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Regulative Mechanismen intrazellulärer Antioxidantien in Staub-exponierten humanen bronchoepithelialen Zellen in vitro und in vivo
Beschreibung
Einleitung: Neben der Katalase und dem Glutathionsystem werden die Superoxid-Dismutasen (SOD), bestehend aus der im Zytosol lokalisierten Kupfer-/Zink-Superoxid-Dismutase (Cu2+/Zn2+ SOD) und der mitochondrialen Mangan-Superoxid-Dismutase (MnSOD), als die wichtigsten antioxidativ wirkenden Enzyme in Säugetierzellen angesehen. Antioxidantien schützen die wegen ihrer Barriere- und Stoffwechselfunktion wichtigen bronchoepithelialen Zellen auch vor Staub-induzierten reaktiven Sauerstoffmetaboliten.
Aufgabenstellung: Quantifizierung antioxidativer Protektionsmechanismen nach Staubexposition in bronchoepithelialen Zellen mit Betonung auf der genetisch regulierten SOD.
Studiendesign/Methodik: Das Forschungsvorhaben gliedert sich in zwei Abschnitte:
- a
- Im in vitro Teil wurden nach Exposition einer humanen bronchoepithelialen Zellinie (BEAS 2B) mit verschiedenen Stäuben (UICC [Union Internationale Contre le Cancer]-Krokydolith [KR], Steinwolle [SW] und Quarz [Si]; Konzentrationsbereich: 2-50 µg/cm2, Inkubationszeit: 24 h) folgende Quantifizierungen durchgeführt: MnSOD mRNA, Cu2+/Zn2+ SOD mRNA (jeweils mittels Northern-Analysen), intrazelluläre SOD-Aktivitäten (kinetische Assays), und SOD-Enzymkonzentrationen (ELISA: enzyme linked immunosorbent assay).
- b
- Um die Frage zu beantworten, ob sich die in vitro gewonnenen Ergebnisse auf die in vivo Situation übertragen lassen, wurden Probanden (n=61: stattgehabte Asbest- [n=8] bzw. Quarzmischstaub-Exposition [n=8]; nicht-staubexponierte Probanden: Raucher [n=19], Nichtraucher [n=26]) rekrutiert, bronchoskopiert und biopsiert. In den Bronchialschleimhautbiopsien wurden bestimmt: MnSOD mRNA (semiquantitative RT-PCR), SOD-Aktivitäten (s.o.), SOD-Enzymkonzentrationen (s.o.), morphologische Lokalisation der MnSOD (mRNA: In-situ-Hybridisierung; Enzym: immunhistochemische Analysen).
Ergebnisse/Diskussion:
- ad a) Die initial sehr niedrigen MnSOD mRNA-Werte ruhender nicht-exponierter BEAS 2B-Zellen stiegen schon bei geringer KR-Exposition (>2 µg/cm2) signifikant (p<0,01) an und fielen bei höheren KR-Konzentrationen (>10-50 µg/cm2) wieder ab. Im Gegensatz dazu veränderte sich die schon initial in nicht-exponierten Zellen erhöhte Cu2+/Zn2+ SOD mRNA durch eine KR-Exposition (>2 µg/cm2) nicht. Bei den o.g. höheren KR-Konzentrationen zeigte sich, wie bei der MnSOD mRNA, ein abfallendes Reaktionsmuster. Diese Reduktion ist die Folge eines beginnenden zytotoxischen KR-Effekts (siehe PUG-Bericht 1996, PUG LUVA 95 006). Der MnSOD mRNA-Anstieg bei den mit SW und Si exponierten Zellen war ähnlich. Ab Si-Konzentrationen von >25 µg/cm2 sank die MnSOD mRNA. Im Gegensatz dazu trat eine SW-bedingte MnSOD und Cu2+/Zn2+ SOD mRNA-Reduktion nicht auf. Damit hatten alle Stäube eine MnSOD mRNA induzierende Wirkung, die jedoch bei KR und Si durch die zunehmende Staub-induzierte Zytotoxizität abnahm: KR>Si>SW. Während bei KR die SOD-Aktivität und die MnSOD-Enzymkonzentrationen anstiegen (KR 3 µg/cm2, 96 h Inkubation), verhielten sich die entsprechenden Werte nach Si und SW uneinheitlich.
- ad b) Die in vitro erhobenen Ergebnisse lassen sich nicht auf die in vivo Situation übertragen, da sich bezüglich der MnSOD mRNA, der SOD-Aktivitäts- und der SOD-Enzymbestimmungen zwischen den Staub- und nicht-staubexponierten Probanden keine signifikanten Unterschiede errechneten. Eine jahrzehntelange Zigarettenrauchexposition erwies sich dagegen als starker MnSOD mRNA-Induktor: Anstieg um das 4,3-fache gegenüber Nichtrauchern (p<0,001). In der In-situ-Hybridisierung und Immunhistochemie zeigte sich eine vorzugsweise in den bronchoepithelialen Zellen lokalisierte MnSOD Expression. Eine SOD-Aktivitäts- oder SOD-Enzymerhöhung ließ sich bei den Rauchern nicht nachweisen. Diese im Vergleich zu den erhöhten MnSOD mRNA-Werten bestehende Diskrepanz wurde als erhöhter Enzymumsatz bei kompensatorisch erhöhten mRNA-Spiegeln gewertet.
Zusammenfassung: Alle getesteten Stäube (KR, Si, SW) zeigten in vitro einen prooxidativen Effekt (MnSOD-Induktion). KR, bei höheren Konzentrationen auch Si (nicht aber SW) wirkten zytotoxisch. In vivo scheinen die durch eine Staubexposition verursachten prooxidativen Effekte im Gegensatz zu dem Zigarettenrauch-bedingten Einfluß nur eine untergeordnete Rolle zu spielen. Zigarettenrauch ist nach unseren in vivo erhobenen Ergebnissen somit der stärkste Induktor einer zelleigenen antioxidativen Abwehrreaktion.